Pregabalin ist kein GABAA- oder GABAB-Rezeptoragonist.
Pregabalin ist ein Gabapentinoid und wirkt durch Hemmung bestimmter Kalziumkanäle. Insbesondere ist es ein Ligand der Hilfsstelle der α2δ-Untereinheit bestimmter spannungsabhängiger Calciumkanäle (VDCCs) und wirkt dadurch als Inhibitor von VDCCs, die eine α2δ-Untereinheit enthalten. Es gibt zwei arzneimittelbindende α2δ-Untereinheiten, α2δ-1 und α2δ-2, und Pregabalin zeigt eine ähnliche Affinität für diese beiden Stellen (und daher mangelnde Selektivität zwischen ihnen). Pregabalin bindet selektiv an die α2δ-VDCC-Untereinheit. Obwohl Pregabalin ein GABA-Analogon ist, bindet es nicht an die GABA-Rezeptoren, wandelt sich in vivo nicht in GABA oder einen anderen GABA-Rezeptoragonisten um und moduliert den GABA-Transport oder -Metabolismus nicht direkt. Es wurde jedoch festgestellt, dass Pregabalin einen dosisabhängigen Anstieg der Gehirnexpression von L-Glutaminsäure-Decarboxylase (GAD) hervorruft, dem Enzym, das für die Synthese von GABA verantwortlich ist, und daher möglicherweise einige indirekte GABAerge Wirkungen hat, indem es die GABA-Spiegel im Gehirn erhöht. Derzeit gibt es keine Hinweise darauf, dass die Wirkung von Pregabalin durch einen anderen Mechanismus als die Hemmung von α2δ-haltigen VDCCs vermittelt wird. Dementsprechend scheint die Hemmung von α2δ-1-haltigen VDCCs durch Pregabalin für dessen antikonvulsive, analgetische und anxiolytische Wirkung verantwortlich zu sein.
Die endogenen α-Aminosäuren L-Leucin und L-Isoleucin, die in ihrer chemischen Struktur Pregabalin und den anderen Gabapentinoiden sehr ähneln, sind offensichtliche Liganden der α2δ-VDCC-Untereinheit mit ähnlicher Affinität wie die Gabapentinoide (z. B. IC50 = 71 nM für L- Isoleucin) und kommen im menschlichen Liquor in mikromolaren Konzentrationen vor (z. B. 12,9 μM für L-Leucin, 4,8 μM für L-Isoleucin). Es wurde die Theorie aufgestellt, dass sie die endogenen Liganden der Untereinheit sein könnten und dass sie die Wirkung von Gabapentinoiden kompetitiv antagonisieren könnten. Während Gabapentinoide wie Pregabalin und Gabapentin nanomolare Affinitäten zur α2δ-Untereinheit aufweisen, liegen ihre Wirksamkeiten in vivo im niedrigen mikromolaren Bereich, und die Konkurrenz um die Bindung durch endogene L-Aminosäuren soll wahrscheinlich für diese Diskrepanz verantwortlich sein.

In einer Studie wurde festgestellt, dass Pregabalin eine sechsfach höhere Affinität für α2δ-Untereinheiten enthaltende VDCCs als Gabapentin besitzt. Eine andere Studie ergab jedoch, dass Pregabalin und Gabapentin ähnliche Affinitäten zur menschlichen rekombinanten α2δ-1-Untereinheit hatten (Ki = 32 nM bzw. 40 nM). In jedem Fall ist Pregabalin als Analgetikum zwei- bis viermal wirksamer als Gabapentin und scheint bei Tieren als Antikonvulsivum drei- bis zehnmal wirksamer zu sein als Gabapentin.